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技术支持

普通 PCR、实时荧光定量 PCR 和数字 PCR 对比分析
发布时间:2019-08-08   点击次数:235次

 提起 PCR,在生物及其相关行业内可谓如雷贯耳,无人不知无人不晓,其影响之深,应用之广可见一斑。
    1985 年,美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了聚合酶链反应(PCR),实现了在试管中模拟细胞内的 DNA 复制。然而,采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA 聚合酶。 耐热 DNA 聚合酶的应用使得 PCR 能高效率的进行,随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循环仪,从此拉开了 PCR 大展拳脚的序幕。
    根据 PCR 的发展进程,本文将对普通 PCR、实时荧光定量 PCR 和数字 PCR 这三代 PCR 进行分析,期望对 PCR 感兴趣的读者能从中有所收获。

普通 PCR

基本原理
    PCR(聚合酶链式反应)是一种体外 DNA 扩增技术,是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应,将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经「高温变性—低温退火 —引物延伸」三步反应的多次循环,使 DNA 片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

PCR 反应体系举例

10×扩增缓冲液      

10µl 

4 种 dNTP 混合物   

各 100~250μmol/L

引物                   

各 5~20μmol/L

模板 DNA                 

0.1~2µg

Taq DNA 聚合酶   

5~10U

Mg2+                  

1~3mmol/L  

加双或三蒸水至    

100µl

仪器与耗材

    基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备,能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制。这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的,各有其优缺点,在此不再赘述。

结果检测

    PCR 反应扩增出很高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性不太高,引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判,但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。

应用

    PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制,最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的 DNA,就能用 PCR 加以放大,进行比对。这也是「微量证据」的威力之所在。


实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) 

基本原理

    qPCR 技术是在反应体系中加入荧光报告基团和荧光淬灭基团,随着 PCR 反应的进行,扩增产物不断积累,导致荧光信号不断积累, 从而利用荧光信号的变化实时监测整个 PCR 进程。
    根据 PCR 定量原理公式可推导出, 模板起始拷贝数的对数与阈值循环数呈线性关系,模板起始拷贝数越多,荧光信号达到阈值的循环数越少,即 Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线,根据荧光基团发出的荧光强度与 PCR 扩增产物的数量呈对应关系, 只要对荧光信号进行实时监测并得到未知样品的 Ct 值,即可通过标准曲线计算未知样品的起始拷贝数。
    Ct 值指 PCR 扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。相同模板进行 96 次扩增,终点处产物量不恒定,但 Ct 值却极具重现性。


    模板 DNA 量越多,荧光达到域值的循环数越少,即 Ct 值越小。Log 起始模板浓度与 Ct 呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,根据样品 Ct 值,就可以计算出样品中所含的模板量。

 

 

目前常用荧光标记方法

方法

优点

缺点

应用范围

SYBR Green I

适用性广

灵敏

方便

便宜

引物要求高

易出现非特异条带

科研中对各种目的基因定量分析,基因表达量的研究,转基因重组动植物研究

Taqman

特异性高

重复性好

价格高

只适合特定目标

病原体检测,疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病诊断

分子信标

高特异性

荧光背景低

只适合特定目标

设计困难

价格高

特定基因分析,SNP分析

 

荧光定量 PCR 反应体系举例

试剂

含量

2xGoTaq Master Mix

5µl

无核酸酶水

3.5µl

上游引物

0.25µl

下游引物

0.25µl

基因组 DNA

1µl(约20ng)梯度稀释

共 10µl

 

仪器与耗材

    在普通 PCR 仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,就成了荧光定量 PCR 仪。其 PCR 扩增原理和普通 PCR 仪扩增原理相同,只是 PCR 扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出,把这 PCR 仪叫做实时荧光定量 PCR 仪 (qPCR 仪)。荧光定量 PCR 仪有单通道,双通道,和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道,有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测,生物医药研发,食品行业,科研院校等机构。

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